Čebele in virusi

Ivanka Cizelj, iz Zbornika ob 130-letnici delovanja ČD Henrik Peternel Celje (2006)

Čebele in virusi

Pomen virusov v patologiji medonosne čebele je iz leta v leto večji. Onesnaževalci okolja so dramatično zmanjšali populacije več vrst žuželk in vloga čebel kot opraševalcev rastlin je postala še bolj pomembna. Virusne infekcije, ki povzročijo propad čebelje družine oziroma oslabijo čebeljo kolonijo, ne prizadenejo le čebelarstva, pač pa se posledice odražajo tudi v kmetijstvu, predvsem v sadjarstvu.

Ob povečanem propadu čebeljih družin napadenih z ektoparazitom Varroa destructor se je začelo govoriti tudi o vlogi čebeljih virusov. Nedavne raziskave so pokazale, da je odločilnega pomena pri virusnih obolenjih varoja, ki oslabi čebeljo družino, aktivira virusno infekcijo, ter deluje kot vektor za prenos virusa (Grabensteiner in sod., 2001). Že leta 1985 so pri preučevanju varoje in njenih navad ugotovili, da ima varoja večji vpliv na čebeljo družino kot prenašalec virusa kot pa ektoparazit (Ball, 1985). O čebeljih virusih na Slovenskem ni dosti znanega. Raziskovalna naloga, ki je bila opravljena v letu 2004, je prvi korak v dokazovanju in poznavanju čebeljih virusov pri nas.

Virusne infekcije, ki povzročijo propad

čebelje družine, ne prizadenejo le čebelarstva,

pač pa se posledice odražajo tudi v

kmetijstvu, predvsem v sadjarstvu.

KLASIFIKACIJA VIRUSOV

Virusi, ki povročajo infekcije pri čebelah, so uvrščeni v naddružino Picornaviridae. Zanje je značilno, da so brez ovojnice, so okroglaste oblike, premera 22-33 nm in ikozaedrične simetrije. Virion vsebuje enovijačno pozitivno polarno molekulo RNA (ribonukleinska kislina), dolžine 7,2 do 8,4 kb. Enovijačna, pozitivno polarna RNA pikornavirusov se pomnožuje s pomočjo virusnih replikaz (od RNA odvisnih polimeraz RNA). RNA pikornavirusov je hkrati tudi sporočilna RNA (mRNA), ki se prevede na poliribosomih v citoplazmi gostiteljske celice v poliprotein, ta pa se cepi v več virusnih beljakovin. Nato se sintetizira genomu komplementarna negativno polarna RNA, ki je matrica za sintezo novih molekul pozitivno polarne RNA.

Virusi nevretenčarjev, morfološko in fizikalno-kemično podobni pikornavirusom, so bili prvotno dokazani pri medonosni čebeli (Apis mellifera) v letih 1963, 1964 (Bailey in sod., 1963, 1964). Kasneje je bilo pri nevretenčarjih odkritih veliko virusov z majhno količino RNA, ki so jih uvrstili v novo ali pa v že obstoječo virusno družino. Samo trije virusi od teh so bili tudi uradno uvrščeni v družino Picornaviridae. To so virus paralize čričkov (Cricket paralysis virus), Drosofila C virus in Gonometa virus. Ostalo je približno 40 virusov, ki jih imenujemo “picorna like” virusi oziroma virusi, ki so podobni pikornavirusom.

Ti virusi imajo enovijačno pozitivno polarno molekulo RNA in 25 – 30 nm v premeru. Molekulska masa genoma je 2,5 – 3,0 milijone daltonov (MDa) (Christian in Scotti, 1999).

Pri evropski medonostni čebeli so izolirali najmanj 16 pikornavirusom podobnih virusov, med drugim tudi: virus akutne paralize (angl. acute bee paralysis virus – ABPV), Kašmirski virus čebel (angl. Kashmir bee virus – KBV), Virus mešičkaste zalege (angl. Sacbrood virus – SBV), virus deformiranih kril (angl. deformed wing virus – DWV), virus kronične paralize čebel (angl. cronic bee paralysis virus – CBPV), virus črnih matičnikov (angl. black queen cell virus – BQCV), čebelji X in Y virus, filamentozni virus (angl. filamentous virus), virus motnih kril (angl. Cloudy wing virus – CWV), Egipčanski virus čebel (angl. Egypt bee virus – EBV) in virus počasne paralize (angl. slow paralysis virus – SPV). Večina čebeljih virusov povzroči inaparentno infekcijo, ki pa jo lahko aktivirajo različni faktorji okolja, kot so čebelji zajedalci, med njimi sta najpomembnejša Nosema apis in Varroa jacobsoni, in pesticidi (Ball in Allen, 1988; Bromenshenk in sod., 1991).

Najpogosteje se čebele okužijo z virusom z zaužitjem intaktnega viriona med hranjenjem. Zaužiti virusni delci lahko poškodujejo epitelne celice tankega črevesa ali pa prehajajo skozi črevesno steno in poiščejo tarčne celice v telesu čebele. Čebelji virusi so politrofični, saj prizadenejo večino tkiv čebele (Ratcliffe in sod., 1985).

OPIS NEKATERIH ČEBELJIH VIRUSOV

DOKAZOVANJE VIRUSNIH INFEKCIJ ČEBEL

Dokazovanje čebeljih virusov je do nedavnega temeljilo na tradicionalnih metodah kot so elektronska mikroskopija, imunodifuzija, encimska imunoadsorbcija (ELISA). Te tehnike imajo majhno specifičnost in občutljivost. Gojenje teh virusov na celični kulturi ni možno, saj nimamo na razpolago nobene celične linije za izolacijo čebeljih virusov (Anderson, 1984).

Danes poznamo zaporedja RNA (ribonukleinska kislina – angl. ribonucleid acid) vseh pomembnejših čebeljih RNA virusov, kar nam omogoča uporabo teh zaporedij za natančno identifikacijo in dokazovanje virusov z metodo polimerne verižne reakcije (PCR) (Grabensteiner in sod., 2001; Benjeddou in sod., 2001). PCR je relativno nova metoda za sintezo nukleinskih kislin in vitro, s katero lahko v kratkem času pomnožimo specifično DNA (deoksi ribonukleinska kislina – angl. deoxy ribonucled acid) v velikem številu kopij.

Metodo je razvil dr. Kary Mullis leta 1983 in 10 let kasneje za to odkritje dobil Nobelovo nagrado na področju kemije. PCR je zelo vsestranska metoda in jo uporabljajo na področjih genskega kloniranja in manipulacije nukleinskih kislin, sekveniranja DNA, analiz DNA arheoloških najdb, dokazovanja patogenih mikroorganizmov, detekcij mutacij ter na področju forenzične tipizacije DNA. V virologiji PCR predstavlja metodo, brez katere moderno raziskovalno in diagnostično delo danes ni več mogoče.

Dokazovanje virusov z metodo PCR temelji na in vitro pomnoževanju za določen virus specifičnega odseka njegovega dednega materiala (Remick in sod., 1990; Eeles in sod., 1992). Glavni predpogoj za uspešno pomnoževanje je predhodno poznavanje nukleotidnega zaporedja vsaj enega dela virusnega genoma (Remick in sod., 1990), kar nam omogoči pravilno izbiro dveh kratkih odsekov, t.i. začetnih oligonukleotidov, komplementarnih z mejnima deloma specifičnega odseka virusnega genoma, ki ga želimo pomnožiti. Začetna oligonukleotida se spajata z nasprotno ležečo vijačnico tarčnega odseka virusne DNA in sta usmerjena tako, da poteka sinteza nove DNA v prostoru med njima. Velikost novo nastalih delcev DNA je torej odvisna od njune medsebojne razdalje (Templeton, 1992; Remick in sod., 1990). PCR poteka v ciklusih in vsak ciklus teoretično podvoji število tarčnih molekul DNA, ki pri tem eksponentno narašča. Tako po 40-tih ciklusih iz ene molekule DNA dobimo teoretično 240 = 1,1 x 1012 kopij DNA (Saiki in sod., 1988).

Ker z metodo PCR lahko pomnožujemo samo molekule DNA, je potrebno pred izvajanjem PCR izolirano RNA prepisati v komplementarno DNA – cDNA z reverzno transkripcijo (RT). Za RT potrebujemo encim, od RNA odvisno polimerazo DNA, ki ga imenujemo reverzna transkiptaza. Metoda RT-PCR se uporablja za dokazovanje večine RNA virusov, tudi za pikornavirusom podobne viruse insektov (Canning in sod., 1996; Jonson in Christian, 1999; Hung in Shimanki, 1999). Metoda je zanesljiva, specifična, občutljiva ter omogoča dokazovanje in identifikacijo zelo majhnih količin virusa prisotnega v čebeli (Grabensteiner in sod., 2001; Benjeddou in sod., 2001).

Z metodo RT-PCR smo v raziskovalni nalogi, ki je bila opravljena leta 2004, preiskali na čebelje viruse 45 odmrlih čebeljih družin. Ugotavljali smo prisotnost virusa akutne paralize čebel, virusa deformiranih kril, kašmirskega virusa čebel in virusa mešičkaste zalege. Kar 64% odmrlih čebeljih družin je bilo napadenih z varojo. Odstotek čebeljih družin napadenih z varojo je v Sloveniji verjetno precej višji, saj so bili naši vzorci nabrani naključno in se podnica panja, kjer pogosto najdemo poginulo varojo, ni pregledovala. Problematika varoje z leti narašča. Družine, močno napadene z varojo, hitro slabijo. Za hitrejši propad družine je pogosto vzrok sekundarna okužba z virusi, ki jih prenaša varoja. Pri slovenskih čebelah smo potrdili in dokazali prisotnost virusa akutne paralize čebel, virusa deformiranih kril in virusa mešičkaste zalege. Z virusom deformiranih kril je bilo inficiranih največ čebel (80%), virus akutne paralize čebel smo dokazali pri 60% čebel, virus mešičkaste zalege pa smo dokazali le v čebelji družini, ki je propadla s kliničnimi znaki mešičkaste zalege. Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo, da je okuženost slovenskih čebel z ABPV in DWV zelo visoka. Odsotnost Kašmirskega virusa čebel pa ne dokazuje, da tega virusa v Sloveniji ni. Raziskava je potrdila povezavo med varojo in virusoma akutne paralize in deformiranih kril, ker smo virusa dokazali tudi pri pršici. ABPV in DWV se lahko prenašata tudi brez varoje – imeli smo primere propadlih čebeljih družin, pri katerih smo dokazali virus, niso pa bile napadene z varojo (Cizelj in Gregorčič, 2004).

Za prihodnost čebelarstva na Slovenskem sta zelo zaskrbljujoča visoka okuženost čebeljih družin z virusi in visok odstotek pojavljanja varoje. Slovenski čebelar se mora zavedati, da je boj proti varozi tudi boj proti čebeljim virusom in v tej bitki lahko zmaga le s sistemskim, dolgotrajnim in vztrajnim zatiranjem varoje in ohranjanjem močnih čebeljih družin.

Ivanka Cizelj

Viri in literatura so navedeni v raziskovalni nalogi z naslovom: Dokazovanje virusnih infekcij pri odmrlih čebeljih družinah Apis mellifera carnica, ki je bila opravljna na Veterinarski fakulteti leta 2004.

Posted in Iz znanosti in prakse